Guida alla creazione di un semplice tampone fosfato

In chimica, a buffersoluzione serve a mantenere un pH stabile quando una piccola quantità di acido o base viene introdotta in una soluzione. Una soluzione tampone fosfato è particolarmente utile per applicazioni biologiche, che sono particolarmente sensibili alle variazioni di pH poiché è possibile preparare una soluzione vicino a uno dei tre livelli di pH.

I tre valori di pKa per l'acido fosforico (dal Manuale CRC di chimica e fisica) sono 2.16, 7.21 e 12.32. Il fosfato monosodico e la sua base coniugata, il fosfato disodico, vengono solitamente utilizzati per generare tamponi con valori di pH intorno a 7, per applicazioni biologiche, come mostrato qui.

• Nota: Ricorda che pKa non è facilmente misurabile su un valore esatto. Valori leggermente diversi potrebbero essere disponibili in letteratura da fonti diverse.

La creazione di questo buffer è un po 'più complicata rispetto alla creazione di buffer TAE e TBE, ma il processo non è difficile e dovrebbe richiedere solo circa 10 minuti.

Per preparare il tuo tampone fosfato, avrai bisogno dei seguenti materiali:

• Fosfato monosodico
• Fosfato disodico.
• Acido fosforico o idrossido di sodio (NaOH)
• pHmetro e sonda
• Pallone volumetrico
• Cilindri graduati
• becher
• Mescolare le barre
• Mescolando la piastra riscaldante

Prima di creare un buffer, dovresti prima sapere quale molarità vuoi che sia, quale volume produrre e quale sia il pH desiderato. La maggior parte dei buffer funziona meglio a concentrazioni comprese tra 0,1 M e 10 M. Il pH deve essere compreso entro 1 unità pH della base acido / coniugato pKa. Per semplicità, questo calcolo di esempio crea 1 litro di buffer.

Utilizzare l'equazione di Henderson-Hasselbalch (HH) (sotto) per determinare quale rapporto tra acido e base è necessario per creare un tampone del pH desiderato. Utilizzare il valore di pKa più vicino al pH desiderato; il rapporto si riferisce alla coppia coniugata acido-base che corrisponde a quel pKa.

Equazione HH: pH = pKa + log ([Base] / [Acid])

Per un buffer di pH 6,9, [Base] / [Acido] = 0,4898

Sostituisci per [Acido] e risolvi per [Base]

La molarità desiderata del buffer è la somma di [Acido] + [Base].

Per un buffer da 1 M, [Base] + [Acido] = 1 e [Base] = 1 - [Acido]

Sostituendo questo nell'equazione del rapporto, dal passaggio 2, si ottiene:

[Acido] = 0,6712 moli / L

Risolvi per [Acido]

Utilizzando l'equazione: [Base] = 1 - [Acido], è possibile calcolare che:

[Base] = 0,3288 moli / L

Dopo aver usato il Henderson-Hasselbalch equazione per calcolare il rapporto tra acido e base richiesto per il tampone, preparare poco meno di 1 litro di soluzione usando le quantità corrette di fosfato monosodico e fosfato disodico.

Utilizzare una sonda pH per confermare che è stato raggiunto il pH corretto per il buffer. Regolare leggermente se necessario, usando acido fosforico o idrossido di sodio (NaOH).

Una volta raggiunto il pH desiderato, portare il volume del tampone a 1 litro. Quindi diluire il buffer come desiderato. Questo stesso buffer può essere diluito per creare buffer di 0,5 M, 0,1 M, 0,05 M o qualsiasi altra via di mezzo.

Ecco due esempi di come calcolare un tampone fosfato, come descritto da Clive Dennison, Dipartimento di Biochimica dell'Università di Natal, in Sudafrica.

Il requisito è per un tampone Na-fosfato 0,1 M, pH 7,6.

Nell'equazione di Henderson-Hasselbalch, pH = pKa + log ([sale] / [acido]), il sale è Na2HPO4 e l'acido è NaHzPO4. Un buffer è più efficace nel suo pKa, che è il punto in cui [sale] = [acido]. Dall'equazione è chiaro che se [sale]> [acido], il pH sarà maggiore del pKa, e se [sale]

NaH2PO4 + NaOH - + Na2HPO4 + H20.

Una volta che la soluzione è stata titolata al pH corretto, può essere diluita (almeno su una piccola quantità intervallo, in modo che la deviazione dal comportamento ideale sia piccola) al volume che darà il desiderato molarità. L'equazione HH afferma che il rapporto tra sale e acido, piuttosto che le loro concentrazioni assolute, determina il pH. Nota che:

• In questa reazione, l'unico sottoprodotto è l'acqua.
• La molarità del tampone è determinata dalla massa dell'acido, NaH2PO4, che viene pesata, e dal volume finale a cui è composta la soluzione. (Per questo esempio sarebbero necessari 15.60 g di diidrato per litro di soluzione finale.)
• La concentrazione di NaOH non è preoccupante, quindi è possibile utilizzare qualsiasi concentrazione arbitraria. Ovviamente, dovrebbe essere sufficientemente concentrato per effettuare la variazione di pH richiesta nel volume disponibile.
• La reazione implica che è richiesto solo un semplice calcolo della molarità e una singola pesatura: solo una la soluzione deve essere inventata e tutto il materiale pesato viene utilizzato nel buffer, ovvero non esiste rifiuto.

Si noti che non è corretto ponderare il "sale" (Na2HPO4) in primo luogo, poiché ciò fornisce un sottoprodotto indesiderato. Se viene preparata una soluzione di sale, il suo pH sarà al di sopra del pKa e richiederà una titolazione con un acido per abbassare il pH. Se si utilizza HC1, la reazione sarà:

Na2HPO4 + HC1 - + NaH2PO4 + NaC1,

cedendo NaC1, di una concentrazione indeterminata, che non è desiderata nel buffer. A volte, ad esempio, in un'eluizione del gradiente di forza ionica a scambio ionico, è necessario avere un gradiente di, diciamo, [NaC1] sovrapposto al buffer. Sono quindi necessari due buffer, per le due camere del generatore di gradiente: il buffer di partenza (ovvero il buffer di equilibrazione, senza aggiunta di NaC1, o con il concentrazione iniziale di NaC1) e il tampone di finitura, che è uguale al tampone di partenza ma che contiene inoltre la concentrazione di finitura di NaC1. Nel preparare il tampone di finitura, è necessario tenere conto degli effetti degli ioni comuni (dovuti allo ione sodio).

Esempio come indicato nella rivista Biochemical Education16(4), 1988.

Il requisito è per un tampone di finitura con gradiente a resistenza ionica, tampone Na-fosfato 0,1 M, pH 7,6, contenente 1,0 M NaCl.

In questo caso, il NaC1 viene pesato e composto insieme al NaHEPO4; gli effetti degli ioni comuni sono presi in considerazione nella titolazione e si evitano così calcoli complessi. Per 1 litro di tampone, NaH2PO4.2H20 (15.60 g) e NaC1 (58.44 g) vengono sciolti in circa 950 ml di H20 distillato, titolato a pH 7,6 con una soluzione di NaOH piuttosto concentrata (ma di concentrazione arbitraria) e composto fino a 1 litro.

Esempio come indicato nella rivista Biochemical Education16(4), 1988.