Il campo di biotecnologia è in costante cambiamento. La rapida crescita e lo sviluppo della ricerca all'avanguardia dipendono dall'innovazione e dalla creatività di scienziati e la loro capacità di vedere il potenziale in una tecnica molecolare di base e applicarla a nuove processi. L'avvento della reazione a catena della polimerasi (PCR) ha aperto molte porte alla ricerca genetica, incluso un mezzo per la Analisi del DNA e identificazione di diversi geni in base alle loro sequenze di DNA. Il sequenziamento del DNA dipende anche dalla nostra capacità di utilizzo elettroforesi su gel per separare filamenti di DNA che differiscono per dimensioni di appena una coppia di basi.
Sequenziamento del DNA
Alla fine degli anni '70 furono inventate due tecniche di sequenziamento del DNA per molecole di DNA più lunghe: il metodo Sanger (o dideoxy) e il metodo Maxam-Gilbert (scissione chimica). Il metodo Maxam-Gilbert si basa sulla scissione specifica dei nucleotidi da parte delle sostanze chimiche ed è meglio utilizzato per sequenziare gli oligonucleotidi (polimeri nucleotidici corti, generalmente inferiori a 50 coppie di basi in lunghezza). Il metodo Sanger è più comunemente usato perché è stato dimostrato tecnicamente più facile da applicare e, con l'avvento della PCR e l'automazione della tecnica, è facilmente applicabile a lunghi filamenti di DNA tra cui alcuni interi geni. Questa tecnica si basa sulla terminazione della catena da parte dei dossoxynucleotides durante le reazioni di allungamento della PCR.
Metodo Sanger
Nel metodo Sanger, il filamento di DNA da analizzare viene utilizzato come modello e la DNA polimerasi viene utilizzata, in una reazione di PCR, per generare filamenti complementari mediante primer. Vengono preparate quattro diverse miscele di reazione PCR, ciascuna contenente una certa percentuale di analoghi del dossoxynucleoside trifosfato (ddNTP) a uno dei quattro nucleotidi (ATP, CTP, GTP o TTP).
La sintesi del nuovo filamento di DNA continua fino a quando uno di questi analoghi viene incorporato, a quel punto il filamento viene prematuramente troncato. Ogni reazione di PCR finirà per contenere una miscela di diverse lunghezze di filamenti di DNA, tutte terminanti con il nucleotide che è stato etichettato con dideoxy per quella reazione. Gel elettroforesi viene quindi utilizzato per separare i fili delle quattro reazioni, in quattro corsie separate, e determinare la sequenza del modello originale in base a quali lunghezze di fili terminano con quale nucleotide.
Nella reazione automatizzata di Sanger, vengono utilizzati primer che sono etichettati con quattro diversi tag fluorescenti colorati. Le reazioni di PCR, in presenza dei diversi dossoxynucleotides, vengono eseguite come descritto sopra. Tuttavia, successivamente, le quattro miscele di reazione vengono quindi combinate e applicate a una singola corsia di un gel. Il colore di ciascun frammento viene rilevato mediante un raggio laser e le informazioni vengono raccolte da un computer che genera cromatogrammi che mostrano i picchi per ciascun colore, da cui può essere la sequenza del DNA modello determinato.
Tipicamente, il metodo di sequenziamento automatico è preciso solo per sequenze fino a un massimo di circa 700-800 coppie di basi. Tuttavia, è possibile ottenere sequenze complete di geni più grandi e, in effetti, interi genomi, utilizzando metodi step-sise come Primer Walking e il sequenziamento di Shotgun.
In Primer Walking, una parte praticabile di un gene più grande viene sequenziata usando il metodo Sanger. I nuovi primer vengono generati da un segmento affidabile della sequenza e utilizzati per continuare il sequenziamento della porzione del gene che era fuori dal raggio delle reazioni originali.
Il sequenziamento del fucile comporta una riduzione casuale del segmento di DNA di interesse in modo più appropriato (gestibile) frammenti di dimensioni, sequenziando ciascun frammento e disponendo i pezzi in base alla sovrapposizione sequenze. Questa tecnica è stata semplificata dall'applicazione di software per organizzare i pezzi sovrapposti.