Enzimi di restrizione

Le endonucleasi di restrizione sono una classe di enzima che taglia le molecole di DNA. Ogni enzima riconosce sequenze uniche di nucleotidi in un filamento di DNA, generalmente lungo circa 4-6 coppie di basi. Le sequenze sono palindromiche in quanto il filamento di DNA complementare ha la stessa sequenza nella direzione opposta. In altre parole, entrambi i filamenti di DNA vengono tagliati nella stessa posizione.

Gli enzimi di restrizione si trovano in molti diversi ceppi di batteri in cui il loro ruolo biologico è di partecipare alla difesa cellulare. Questi enzimi limitano il DNA estraneo (virale) che penetra nelle cellule distruggendole. Le cellule ospiti hanno un sistema di modifica della restrizione che metila il proprio DNA in siti specifici per i loro rispettivi enzimi di restrizione, proteggendoli in tal modo dalla scissione. Più di 800 enzimi noti sono stati scoperti che riconoscono più di 100 diverse sequenze di nucleotidi.

Esistono cinque diversi tipi di enzimi di restrizione. Il tipo I taglia il DNA in posizioni casuali fino a 1.000 o più coppie di basi dal sito di riconoscimento. Il tipo III taglia a circa 25 coppie di basi dal sito. Entrambi questi tipi richiedono ATP e possono essere grandi enzimi con più subunità. Gli enzimi di tipo II, utilizzati principalmente in biotecnologia, tagliano il DNA all'interno della sequenza riconosciuta senza la necessità di ATP e sono più piccoli e più semplici.

Gli enzimi di restrizione di tipo II sono denominati in base alle specie batteriche da cui sono isolati. Ad esempio, l'enzima EcoRI è stato isolato da E. coli. La maggior parte del pubblico ha familiarità con E. focolai di coli nel cibo.

Gli enzimi di restrizione di tipo II possono generare due diversi tipi di tagli a seconda che tagli entrambi fili al centro della sequenza di riconoscimento o ciascun filo più vicino a un'estremità del riconoscimento sequenza.

Il taglio precedente genererà "estremità smussate" senza sporgenze di nucleotidi. Quest'ultimo genera estremità "appiccicose" o "coesive" perché ogni frammento di DNA risultante ha una sporgenza che completa gli altri frammenti. Entrambi sono utili per la genetica molecolare DNA ricombinante e proteine. Questa forma di DNA si distingue perché è prodotta dalla legatura (legame insieme) di due o più fili diversi che non erano originariamente collegati tra loro.

Gli enzimi di tipo IV riconoscono il DNA metilato e gli enzimi di tipo V usano gli RNA per tagliare sequenze su organismi invasori che non sono palindromici.

Gli enzimi di restrizione sono utilizzati in biotecnologia per tagliare il DNA in filamenti più piccoli al fine di studiare le differenze di lunghezza dei frammenti tra gli individui. Questo è indicato come polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP). Sono anche usati per la clonazione genica.

Tecniche RFLP sono stati usati per determinare che individui o gruppi di individui presentano differenze distintive nelle sequenze geniche e nei modelli di scissione delle restrizioni in alcune aree del genoma. La conoscenza di queste aree uniche è la base per DNA impronte digitali. Ognuno di questi metodi dipende dall'uso di elettroforesi su gel di agarosio per la separazione dei frammenti di DNA. Il tampone TBE, composto da base Tris, acido borico ed EDTA, è comunemente usato per il gel di agarosio elettroforesi per esaminare i prodotti a base di DNA.

La clonazione spesso richiede l'inserimento di un gene in un plasmide, che è un tipo di un pezzo di DNA. Gli enzimi di restrizione possono aiutare nel processo a causa delle sporgenze a filamento singolo che lasciano quando effettuano i tagli. La DNA ligasi, un enzima separato, può unire due molecole di DNA con estremità corrispondenti.

Quindi, usando enzimi di restrizione con enzimi di DNA ligasi, pezzi di DNA di diverse fonti possono essere usati per creare una singola molecola di DNA.