La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica genetica molecolare per creare copie multiple di un gene e fa anche parte del processo di sequenziamento genico.
Come funziona la reazione a catena della polimerasi
Le copie del gene vengono eseguite utilizzando un campione di DNA e la tecnologia è abbastanza buona per fare più copie da una singola copia del gene trovato nel campione. L'amplificazione PCR di un gene per fare milioni di copie, consente il rilevamento e l'identificazione di sequenze geniche utilizzando tecniche visive basate sulla dimensione e sulla carica (+ o -) del pezzo di DNA.
In condizioni controllate, piccoli segmenti di DNA sono generati da enzimi noti come DNA polimerasi, che aggiungono deossinucleotidi complementari (dNTP) a un pezzo di DNA noto come "modello". Pezzi di DNA ancora più piccoli, detti "primer", vengono utilizzati come punto di partenza per il polimerasi.
I primer sono piccoli pezzi di DNA artificiali (oligomeri), solitamente lunghi tra 15 e 30 nucleotidi. Sono fatti conoscendo o indovinando brevi sequenze di DNA alle estremità del gene che viene amplificato. Durante la PCR, il DNA che viene sequenziato viene riscaldato e i doppi filamenti si separano. Dopo il raffreddamento, i primer si legano al modello (chiamato ricottura) e creano un punto in cui iniziare la polimerasi.
La tecnica della PCR
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata resa possibile dalla scoperta di termofili e termofili enzimi polimerasi (enzimi che mantengono l'integrità strutturale e la funzionalità dopo il riscaldamento ad alta temperature). I passaggi coinvolti nella tecnica PCR sono i seguenti:
- Viene creata una miscela, con concentrazioni ottimizzate del modello di DNA, dell'enzima polimerasi, dei primer e dei dNTP. La capacità di riscaldare il miscela senza denaturare l'enzima consente la denaturazione della doppia elica del campione di DNA a temperature nell'intervallo di 94 gradi Centigrado.
- Dopo la denaturazione, il campione viene raffreddato a un intervallo più moderato, intorno a 54 gradi, che facilita l'annealing (legame) dei primer ai modelli di DNA a filamento singolo.
- Nella terza fase del ciclo, il campione viene riscaldato a 72 gradi, la temperatura ideale per la Taq DNA polimerasi, per l'allungamento. Durante l'allungamento, la DNA polimerasi utilizza il singolo filamento originale di DNA come stampo per aggiungere dNTP complementari alle estremità 3' di ciascun primer e generano una sezione di DNA a doppio filamento nella regione del gene di interesse.
- I primer che si sono ricotti a sequenze di DNA che non corrispondono esattamente non rimangono ricotti a 72 gradi, limitando così l'allungamento al gene di interesse.
Questo processo di denaturazione, ricottura e allungamento viene ripetuto più (30-40) volte, aumentando così esponenzialmente il numero di copie del gene desiderato nella miscela. Sebbene questo processo sarebbe piuttosto noioso se eseguito manualmente, i campioni possono essere preparati e incubati in a termociclatore programmabile, ormai comune nella maggior parte dei laboratori molecolari, e una reazione PCR completa può essere eseguita in 3-4 ore.
Ogni fase di denaturazione interrompe il processo di allungamento del ciclo precedente, troncando così il nuovo filamento di DNA e mantenendolo approssimativamente alla dimensione del gene desiderato. La durata del ciclo di allungamento può essere allungata o ridotta a seconda delle dimensioni del gene di interesse, ma eventualmente, attraverso ripetuti cicli di PCR, la maggior parte dei modelli sarà limitata alla dimensione del solo gene di interesse, poiché saranno stati generati da prodotti di entrambi i primer.
Ce ne sono diversi fattori per il successo della PCR che possono essere manipolati per migliorare i risultati. Il metodo più utilizzato per verificare la presenza del prodotto della PCR è elettroforesi su gel di agarosio. Che viene utilizzato per separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni e alla carica. I frammenti vengono quindi visualizzati utilizzando coloranti o radioisotopi.
L'evoluzione
Dalla scoperta della PCR, sono state scoperte DNA polimerasi diverse dal Taq originale. Alcuni di questi hanno una migliore capacità di "correzione di bozze" o sono più stabili a temperature più elevate, migliorando così la specificità della PCR e riducendo gli errori dall'inserimento del dNTP errato.
Alcune varianti della PCR sono state progettate per applicazioni specifiche e ora vengono utilizzate regolarmente nei laboratori di genetica molecolare. Alcuni di questi sono PCR in tempo reale e PCR con trascrittasi inversa. La scoperta della PCR ha anche portato allo sviluppo del sequenziamento del DNA, DNA impronte digitali e altre tecniche molecolari.