Il tampone TBE (Tris-borato-EDTA) è una soluzione tampone composta da base Tris, acido borico ed EDTA (acido etilendiamminotetraacetico). Questo tampone viene spesso utilizzato per l'elettroforesi su gel di agarosio nell'analisi dei prodotti del DNA risultanti dall'amplificazione della PCR, dai protocolli di purificazione del DNA o dagli esperimenti di clonazione del DNA.
TBE utilizza
Il tampone TBE è particolarmente utile per la separazione di frammenti di DNA più piccoli (MW <1000), come piccoli prodotti di enzima di restrizione digerisce. TBE ha una capacità di buffering maggiore e offre una risoluzione più nitida rispetto al buffer TAE. Il tampone TAE (Tris-acetato-EDTA) è una soluzione composta da base Tris, acido acetico ed EDTA.
La TBE è generalmente più costosa della TAE e inibisce la ligasi del DNA, che può causare problemi se si prevedono successive fasi di purificazione e legatura del DNA. Con i tre semplici passaggi che seguono, scopri come creare il buffer TBE. La creazione non dovrebbe richiedere più di circa 30 minuti.
Quello che ti serve
Per creare il buffer TBE, avrai bisogno solo di quattro sostanze. Gli elementi rimanenti in questo elenco sono attrezzature. Le quattro sostanze richieste sono sale disodico EDTA, base Tris, acido borico e acqua deionizzata.
Per quanto riguarda le attrezzature, avrai bisogno di un pHmetro e di standard di calibrazione, a seconda dei casi. Inoltre, ti occorreranno circa becher o boccette da 600 e 1500 millilitri. A completare le vostre esigenze di attrezzatura sono cilindri graduati, agitatori e piastre di agitazione.
Controlla l'inventario nel laboratorio che utilizzerai per assicurarti di avere tutto il necessario prima di iniziare. Non c'è niente di peggio che doversi fermare nel mezzo della preparazione di una soluzione perché hai esaurito i materiali adeguati.
Se il tuo laboratorio è a scuola o sul posto di lavoro, verifica con il personale adeguato per vedere che hanno tutti gli articoli in magazzino. Ciò potrebbe farti risparmiare tempo ed energia alla fine.
Il peso della formula è abbreviato in FW. È il peso atomico di un elemento moltiplicato per il numero di atomi di ciascun elemento in una formula, quindi sommando tutte le masse di ciascun elemento.
Soluzione di riserva di EDTA
Una soluzione EDTA dovrebbe essere preparata in anticipo. L'EDTA non andrà completamente nella soluzione fino a quando il pH non sarà regolato a circa 8,0. Per una soluzione madre da 500 ml di 0,5 M EDTA, pesare 93,05 grammi di sale disodico EDTA (FW = 372,2). Quindi dissolverlo in 400 millilitri di acqua deionizzata e regolare il pH con NaOH (idrossido di sodio). Successivamente, rabbocca la soluzione fino a un volume finale di 500 millilitri.
Soluzione madre di TBE
Prepara una soluzione madre concentrata (5x) di TBE pesando 54 grammi di base Tris (FW = 121.14) e 27.5 grammi di acido borico (FW = 61,83) e dissolvendo entrambi in circa 900 millilitri di deionizzati acqua. Quindi aggiungere 20 millilitri di 0,5 M (molarità o concentrazione) EDTA (pH 8,0) e regolare la soluzione su un volume finale di 1 litro. Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente ma nelle soluzioni più vecchie si formerà un precipitato. Conservare il tampone in bottiglie di vetro e scartare se si è formato un precipitato.
Soluzione di lavoro di TBE
Per l'elettroforesi su gel di agarosio, è possibile utilizzare un tampone TBE a una concentrazione di 0,5x (diluizione 1:10 dello stock concentrato). Diluire la soluzione madre di 10 volte in acqua deionizzata. Le concentrazioni finali di soluto sono 45 mM di tris-borato e 1 mM (millimolare) di EDTA. Il buffer è ora pronto per l'uso in facendo funzionare un gel di agarosio.