PCR sta per reazione a catena della polimerasi, una tecnica di biologia molecolare per amplificare segmenti di DNA, generando copie multiple usando gli enzimi di DNA polimerasi in condizioni controllate. Solo una singola copia di un segmento o gene del DNA può essere clonata in milioni di copie, consentendo il rilevamento mediante coloranti e altre tecniche di visualizzazione.
Sviluppato nel 1983, il processo di PCR ha reso possibile l'esecuzione Sequenziamento del DNA e identificare l'ordine dei nucleotidi nei singoli geni. Il metodo utilizza il ciclo termico o il riscaldamento e il raffreddamento ripetuti della reazione per la fusione e la replicazione del DNA. Mentre la PCR continua, il "nuovo" DNA viene utilizzato come modello per la replica e ne consegue una reazione a catena, amplificando esponenzialmente il modello di DNA.
Le tecniche di PCR sono applicate in molte aree della biotecnologia incluso ingegneria proteica, clonazione, medicina legale (DNA fingerprinting), test di paternità, diagnosi di malattie ereditarie e / o infettive e per analisi di campioni ambientali.
In medicina legale, in particolare, la PCR è particolarmente utile perché amplifica anche la più piccola quantità di prove del DNA. La PCR può anche essere utilizzata per analizzare il DNA che ha migliaia di anni e queste tecniche sono state utilizzate per identificare qualsiasi cosa, da un mammut di 800.000 anni alle mummie di tutto il mondo.
Procedura PCR
Inizializzazione
Questo passaggio è necessario solo per le DNA polimerasi che richiedono la PCR con avviamento a caldo. La reazione viene riscaldata tra 94 e 96 ° C e mantenuta per 1-9 minuti.
Denaturazione
Se la procedura non richiede l'inizializzazione, la denaturazione è il primo passo. La reazione viene riscaldata a 94-98 ° C per 20-30 secondi. I legami idrogeno del modello di DNA vengono interrotti e vengono create molecole di DNA a singolo filamento.
ricottura
La temperatura di reazione è inferiore tra 50 e 65 ° C e mantenuta per 20-40 secondi. I primer ricotturano sul modello di DNA a singolo filamento. La temperatura è estremamente importante durante questo passaggio. Se fa troppo caldo, il primer potrebbe non legarsi. Se fa troppo freddo, il primer potrebbe legarsi imperfettamente. Un buon legame si forma quando la sequenza di primer corrisponde strettamente alla sequenza del modello.
Estensione / Allungamento
La temperatura durante questo passaggio varia a seconda del tipo di polimerasi. La DNA polimerasi sintetizza un filamento di DNA completamente nuovo.
Allungamento finale
Questo passaggio viene eseguito a 70-74 ° C per 5-15 minuti dopo l'ultimo ciclo di PCR.
Tenuta finale
Questo passaggio è facoltativo. La temperatura viene mantenuta a 4-15 ° C e altera la reazione.
Tre fasi della procedura PCR
Amplificazione esponenziale
Durante ogni ciclo, il prodotto (il pezzo specifico di DNA che viene replicato) viene raddoppiato.
Fase di livellamento
Poiché la DNA polimerasi perde attività e consuma i reagenti, la reazione rallenta.
Altopiano
Non si accumula più prodotto.